Intern
    Lehrstuhl für Lebensmittelchemie

    RMCA

    Prinzip

    Der Random Mutation Capture Assay (RMCA) ist eine genotypselektive Methode, um die Mutationsfrequenz in Zellen und Geweben zu bestimmen. Der RMCA beruht auf einem Restriktionsverdau mit TaqI (Schnittstelle: TCGA), bei dem der Wildtyp geschnitten, Mutanten jedoch nicht geschnitten werden. Im Gegensatz zu phänotypselektiven Bestimmungen kann der RMCA, so wie alle anderen genotypselektiven Mutationsfrequenz-Bestimmungsmethoden, sowohl an kodierenden, als auch an nicht-kodierenden Stellen in einem Genom durchgeführt werden.
    Für den RMCA wird zunächst eine Sequenz innerhalb der genomischen oder mitochondrialen DNA ausgewählt, welche eine Schnittstelle für TaqI enthält. Zunächst wird die genomische DNA isoliert und mit Restriktionsenzymen verdaut, so dass das ausgewählte Fragment (Zielsequenz) entsteht. Die Zielsequenz wird durch Hybridisierung mit einer biotinylierten DNA-Sonde angereichert. Die biotinylierte DNA-Sonde ist komplementär zur Zielsequenz und enthält Desoxy-Uracil-Triphosphat (dUTP) anstatt Desoxy-Thymidin-Triphosphat (dTTP). Nach der Anreicherung der hybridisierten Zielsequenz wird mit TaqI verdaut. Dabei wird die Wildtypsequenz geschnitten; wenn eine Mutation innerhalb dir TaqI-Schnittstelle präsent ist, wird nicht geschnitten. Danach wird die DNA-Sonde mit Uracil-DNA Glykosylase verdaut, damit sie später nicht als Templat in den folgenden Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) dienen kann. Dann wird die Kopienzahl mittels PCR mit Primern, die außerhalb der TaqI-Schnittstelle liegen und die TaqI-Schnittstelle nicht einschließen, ermittelt. Dafür wird eine RealTime-PCR mit externer Kalibrierung durchgeführt. Nach der Kopienzahlbestimmung wird die DNA für die PCR zur Mutantenzahlbestimmung auf eine 96-Lochplatte aufgeteilt, so dass höchstens eine Mutante pro Reaktion vorhanden ist. Dann wird eine PCR mit Primern, die die TaqI-Schnittstelle flankieren durchgeführt. Dabei entsteht nur Produkt, wenn in der Sequenz der Zielsequenz eine Mutation in der TaqI-Schnittstelle präsent ist. Die Mutanten werden anschließend sequenziert um ein falsch positives Ergebnis auszuschließen.

     

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